Главная » Полезно знать » Полимеразная цепная реакция - описание, цели и методы исследования

Полимеразная цепная реакция — описание, цели и методы исследования

Изображение для публикации не задано

ОФС.1.7.2.0013.15 Полимеразная цепная реакция

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Вводится впервые

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой многократное ферментно-опосредованное умножение (амплификацию) заданного участка ДНК длиной от десятков до нескольких тысяч пар оснований (п.о.), границы которого соответствуют коротким олигонуклеотидным последовательностям – праймерам, т.е. ПЦР представляет собой циклический синтез in vitro выбранного фрагмента ДНК. Каждый цикл состоит из трёх этапов: денатурации, гибридизации и синтеза цепи ДНК. Для выявления РНК-содержащих микробов ПЦР проводят после процедуры обратной транскрипции.

Специфичность реакции обеспечивается прежде всего правильным выбором праймеров.

По окончании реакции наличие искомого фрагмента выявляют различными методами. Наиболее распространены электрофоретическое разделение и детекция флуоресценции в режиме реального времени.

ПЦР может применяться как качественная реакция (по принципу «есть – нет»), так и как полуколичественный или количественный метод.

Для проведения анализа могут быть использованы наборы реагентов для ПЦР, зарегистрированные в установленном порядке и валидированные  для соответствующих целей.

Пробоподготовка

Определяемая ДНК может быть выделена из исследуемого образца или может вноситься в реакцию без предварительной подготовки.

В первом случае следует подтвердить, что процедура выделения не влияет на результаты ПЦР. С этой целью целесообразно провести аналогичную процедуру выделения с использованием стандартного образца ДНК. Процедура выделения может быть ручной или в автоматическом режиме.

Во втором случае при внесении в реакцию тестируемого материала без проведения его предварительной подготовки, необходимо подтвердить отсутствие влияния на результаты ПЦР веществ, входящих в состав исследуемого образца. Для этого целесообразно использовать метод добавок.

Необходимо предусмотреть использование стандартных или контрольных образцов для оценки эффективности выделения нуклеиновых кислот.

Используемое оборудование, реагенты, стандартные и контрольные образцы, приготовление растворов и все этапы пробоподготовки должны быть указаны в фармакопейной статье и нормативной документации или должна быть приведена ссылка на инструкцию по применению набора реагентов для выделения ДНК/РНК.

Проведение реакции

ПЦР проводят в буферно-солевом растворе с определенным значением рН, содержащем необходимую концентрацию ионов магния, четыре вида дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и термостабильную Taq-полимеразу (ДНК-полимераза ряда микроорганизмов, например, Termus aquaticus обладает уникальным свойством сохранять активность при температуре 95°С). Состав буферного раствора, концентрацию реагентов, приготовление растворов указывают в фармакопейной статье и нормативной документации или приводят ссылку на инструкцию по применению набора реагентов для ПЦР. Реакция инициируется парой праймеров, каждый из которых представляет собой  последовательность из 20-25 нуклеотидов, один праймер комплементарен последовательности ДНК с 5’-конца амплифицируемого участка, а другой – с 3’-конца. Последовательность праймеров, их концентрацию указывают в фармакопейной статье и нормативной документации.

Для оценки эффективности амплификации следует использовать положительные и отрицательные стандартные и/или контрольные образцы, указанные в фармакопейной статье и нормативной документации или в инструкции по применению набора реагентов.

ПЦР осуществляют в автоматическом режиме на специальных программируемых приборах – амплификаторах, контролирующих заданные параметры реакции: температуру и длительность отдельных этапов цикла (денатурация, гибридизация и синтез цепи ДНК), число циклов и т.д.

Денатурация. Выдерживание при температуре от 94 до 96 °С в течение установленного времени; при этом двойная цепь денатурируется (расплетается) с образованием двух одноцепочечных молекул ДНК.

Гибридизация (отжиг). При температуре 45 – 65 °С в течение установленного времени происходит гибридизация праймеров и одноцепочечной ДНК-матрицы, в процессе которого праймеры распознают комплементарные им участки матричной ДНК.

Синтез цепи ДНК (элонгация). При температуре 65 — 72 °С в течение установленного времени происходит репликация (достраивание) одной из одноцепочечных ДНК от точки связывания праймера «вправо» (для одной цепи ДНК) и «влево» (для другой цепи ДНК). В результате вновь синтезируемые молекулы ДНК становятся, в свою очередь, матрицей для аналогичного синтеза новых копий.

Продолжительность цикла составляет 0,5 — 5 мин. Сразу после окончания первого цикла процедура повторяется и происходит экспоненциальное увеличение содержания фрагментов ДНК. Обычно ПЦР состоит из 25-40 циклов. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка ДНК, приводящее к увеличению в геометрической прогрессии общего содержания продуктов реакции.

Эффективность ПЦР и количество синтезированного при этом заданного фрагмента ДНК зависит от многих факторов, среди которых следует выделить: тип и термопроводящие характеристики амплификатора, тип используемой ДНК-полимеразы, состав буферного раствора, объем реакционной смеси; длину и первичную структуру праймеров; выбранную специфическую последовательность ДНК.

Используемое оборудование и режим амплификации указывают в фармакопейной статье и нормативной документации или приводят ссылку на инструкцию по применению набора реагентов для ПЦР.

Детекция продуктов амплификации

Электрофоретическое разделение. Продукты амплификации  анализируют с помощью различных методов электофореза в агарозном или полиакриламидном гелях. Для визуализации ДНК используют окрашивание интеркалирующим красителем (обычно — бромистым этидием, дающим характерное красноватое свечение при исследовании в проходящем ультрафиолетовом свете), серебра нитратом или используют мечение различными флюорохромами, дающими флюоресценцию определенной длины волны при возбуждении лазерным лучом. Для оценки размеров амплифицированных фрагментов используют маркеры и стандартные образцы.

Концентрацию геля, приготовление растворов, маркеры, стандартные образцы и условия электрофореза указывают в фармакопейной статье или нормативной документации.

Детекция флюоресценции в режиме реального времени. Способ детекции амплифицированного фрагмента с использованием флюоресцентных меток возможен при проведении ПЦР в реальном времени (Real Time PCR). Отличительной чертой данного метода, в сравнении с классической ПЦР, является возможность не только качественного (по конечной точке или в режиме «реального времени»), но и количественного определения ДНК/РНК в исследуемом материале, отсутствие стадии электрофореза и автоматическая регистрация детектируемого сигнала.

Метод основан на измерении флуоресцентного сигнала в каждом цикле амплификации. Интенсивность сигнала пропорциональна концентрации продукта ПЦР, что в сочетании с возможностью оценить кинетику процесса позволяет проводить количественное определение выбранной последовательности.

Для постановки ПЦР в реальном времени необходим амплификатор, обладающий способностью возбуждать и детектировать флуоресценцию на каждом цикле амплификации. Прибор состоит из трех блоков: амплификатора (термический блок), флуоресцентного детектора и компьютера с прилагаемым программным обеспечением.

Для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени используют интеркалирующие красители (например, SybrGreen I) или специфические флюоресцентные зонды (например, система TaqMan). В первом варианте флюоресцентный краситель связывается с синтезируемой двухцепочечной ДНК с возникновением флюоресцентного свечения.

Во втором варианте используются ДНК-зонды, в состав которых введена флуоресцентная метка и гаситель флуоресценции. На стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и по достижении участка зонда расщепляет его, благодаря наличию 5′-экзонуклеазной активности. В результате происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к появлению детектируемого свечения.

Используемые реагенты, оборудование, условия ПЦР и программу расчета указывают в фармакопейной статье и нормативной документации или приводят ссылку на инструкцию по применению набора реагентов для ПЦР.

Оценка результатов

Полученные результаты учитывают, если одновременные испытания положительных и отрицательных стандартных или контрольных образцов дают соответственно положительные и отрицательные ответы.

При необходимости определения нуклеиновой кислоты, для которой установлено предельно допустимое содержание ДНК, следует проводить сравнение с результатом ПЦР стандартного образца с соответствующей концентрацией.

Для количественного определения специфической нуклеиновой кислоты следует использовать метод ПЦР в реальном времени и стандартный образец, аттестованный в установленном порядке.

Обеспечение качества

Используемое оборудование должно быть аттестовано в установленном порядке.

Методика на основе ПЦР для неколичественного определения должна быть охарактеризована по специфичности и аналитической чувствительности. Аналитическую чувствительность определяют как  минимальное количество целевых последовательностей (ДНК/РНК) в единице объема образца, которое может быть обнаружено в 100 % образцов при 10-кратном проведении анализа или в 95 % образцов при 24-кратном проведении анализа. Количество ДНК/РНК может быть выражено в международных единицах или числом копий.

Методика для количественного определения должна быть охарактеризована по специфичности, диапазону линейности, правильности и прецизионности. Для установления указанных характеристик используются соответствующие международные стандартные образцы, а также стандартные образцы, аттестованные в установленном порядке.

Стандартные и контрольные образцы

Используемые стандартные образцы должны быть аттестованы в установленном порядке, контрольные образцы – охарактеризованы по необходимым показателям. Могут использоваться стандартные и контрольные образцы набора реагентов после валидации методики.

При каждой постановке ПЦР необходимо предусмотреть использование следующих образцов:

  • положительный стандартный и/или контрольный образец, предназначенные для оценки эффективности всех этапов ПЦР, которые должны содержать определенное количество целевой последовательности;
  • положительный контрольный образец, содержащий определенное количество целевой последовательности, предназначенный для оценки этапа амплификации;
  • отрицательный контрольный образец, являющийся свободным от целевых последовательностей, для контроля отсутствия ложноположительных результатов, начиная с этапа пробоподготовки;
  • отрицательный контрольный образец, являющийся свободным от целевых последовательностей, для контроля отсутствия ложноположительных результатов на этапе амплификации.

Скачать в PDF ofs-1-7-2-0013-15-polimeraznaya-tsepnaya-reaktsiya

ГОСТ Р 57989-2017Группа Н59

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРОДУКЦИЯ ПИЩЕВАЯ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННАЯ

Методы выявления патогенных микроорганизмов на основе полимеразнойцепной реакции

Specialized food products. Methods for the detection of foodbornepathogens based on polymerase chain reaction

ОКС 07.100.3067.050

Датавведения 2019-01-01

Предисловие

Предисловие

1РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением науки»Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии ибезопасности пищи» (ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»),Федеральным бюджетным учреждением науки «Центральныйнаучно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора(ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора)

2ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 036 «Продукцияпищевая специализированная»

3УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ ПриказомФедерального агентства по техническому регулированию и метрологииот 24 ноября 2017 г. N 1825-ст

4ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕПравила применениянастоящего стандарта установлены в статье26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. N 162-ФЗ «Остандартизации в Российской Федерации». Информация обизменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (посостоянию на 1 января текущего года) информационном указателе»Национальные стандарты», а официальный текст изменений и поправок- в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты».В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандартасоответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпускеинформационного указателя «Национальные стандарты». Соответствующаяинформация, уведомление и тексты размещаются также в информационнойсистеме общего пользования — на официальном сайте Федеральногоагентства по техническому регулированию и метрологии в сетиИнтернет (www.gost.ru)

Введение

Методы выявленияпатогенных микроорганизмов на основе полимеразной цепной реакцииявляются альтернативными бактериологическому посеву ипредусматривают ускоренное определение наличия или отсутствия ДНКи, соответственно, бактерий родов Salmonella,Shigella, Cronobacter (Enterobactersakazakii), энтерогеморрагических Escherichia coli,термофильных Campylobacter spp. видов C. jejuni,C. coli, C. lari, Listeria monocytogenes вопределенной массе (объеме) пищевого продукта, подвергнутогоинкубации в жидких селективных питательных средах. Предварительнаяинкубация продуктов в питательных средах является обязательнымэтапом анализа, обеспечивающим биологическое накоплениевозбудителей.При наличииэпидемиологических данных о возможности массивного зараженияпищевого продукта искомыми возбудителями входе расследованиявспышек пищевых отравлений и инфекций допускается анализироватьинкриминированные пробы нативных (не подвергавшихся инкубации вжидких средах обогащения) пищевых продуктов с целью полученияпредварительных данных о причинном агенте вспышки. При этомположительные результаты ПЦР-анализа таких проб должныподтверждаться выделением возбудителя в культуре, а отрицательныерезультаты не должны интерпретироваться и не могут служитьоснованием для прекращения анализа проб с инкубацией.Обнаружение патогенныхмикроорганизмов в пищевых продуктах методом полимеразной цепнойреакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией основано навыявлении последовательностей (фрагментов) ДНК, специфичных длягеномов бактерий родов Salmonella, Shigella, Cronobacter,Campylobacter, энтерогеморрагических Escherichia coli,Listeria monocytogenes. В основе метода лежит амплификациянуклеотидных фрагментов-мишеней ДНК, ферментомTaq-полимеразой в присутствии синтетическихолигонуклеотидных праймеров и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.Гибридизация флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов,присутствующих в составе реакционной смеси, с комплементарнымучастком амплифицируемой ДНК-мишени сопровождается нарастаниемфлуоресценции. Измерение интенсивности флуоресцентного сигналапозволяет регистрировать накопление продуктов амплификации.Методы предусматриваютвысев определенных количеств исследуемых проб пищевых продуктов всоответствующие неселективные и селективные питательные среды,инкубирование посевов для накопления микроорганизмов, экстракциюДНК из культуральной жидкости, амплификацию участка ДНК целевыхбактерий со специфичными праймерами игибридизационно-флуоресцентную детекцию ампликонов, осуществляемуюв одном из двух вариантов: в режиме реального времени в ходе ПЦРлибо после завершения амплификации.При положительныхрезультатах обнаружения патогена жизнеспособность присутствующих впродукте искомых микроорганизмов подтверждают бактериологическимпосевом с соответствующим биохимическим и серологическимтипированием или ПЦР-анализом парных проб (прошедшей и не прошедшейкультуральное обогащение) в режиме реального времени.Методы выявленияпатогенных микроорганизмов на основе полимеразной цепной реакции сгибридизационно-флуоресцентной детекцией могут использоваться длятестирования бактериальных культур микроорганизмов, выделенных изпищевых продуктов бактериологическими методами, с цельюподтверждения их принадлежности к родам Salmonella, Shigella,Cronobacter, Campylobacter (видов С. ejuni, С. coli, С.lari), Listeria (вида L. monocytogenes),энтерогеморрагическим Е. coli в качестве дополнительных кбиохимическим и серологическим методам идентификации.

1Область применения

Настоящий стандартраспространяется на специализированную пищевую продукцию иустанавливает методы выявления патогенных бактерий родовSalmonella, Shigella (в комплексе с энтероинвазивными Е.coli), Cronobacter, энтерогеморрагическихверотоксигенных Escherichia coli, термофильныхCampylobacter spp. видов С. jejuni, С. coli, С. lari,а также Listeria monocytogenes на основе полимеразной цепнойреакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией.

3Термины, определения и сокращения

3.1 Термины иопределенияВнастоящем стандарте применены термины по ГОСТ ISO16140, ГОСТ ISO22118.

3.2 СокращенияВнастоящем стандарте применены следующие сокращения:ЗПВ — забуференнаяпептонная вода;ФБР — фосфатно-буферныйраствор;ТСБДЭ — триптон-соевыйбульон с дрожжевым экстрактом;ТСАДЭ — триптон-соевыйагар с дрожжевым экстрактом;RVS-бульон — средаРаппапорта-Вассилиадиса с соей;МКТ-бульон -Мюллер-Кауфман тетратионатный бульон;МПБ — мясо-пептонныйбульон;МПА — мясо-пептонныйагар;ПЦР-FEP — полимеразнаяцепная реакция с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктовамплификации по конечной точке;ПЦР-FRT — полимеразнаяцепная реакция с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктовамплификации в режиме реального времени;ВКО — неконкурентныйвнутренний контрольный образец на основе рекомбинантной ДНК;Ct (пороговый цикл) -значение цикла амплификации, при котором регистрируется пересечениекривой накопления флуоресцентного сигнала с установленной пороговойлинией.